Nació, probablemente, en el castillo de Jadraque (Guadalajara) A la muerte del padre, en 1523, Mencía de Mendoza heredó el título nobiliario, al no tener ningún hermano varón. Un año después contrajo matrimonio con Enrique III de Nassau, camarero mayor y consejero de Carlos V. Este matrimonio la llevó finalmente a la patria de su esposo, donde residió en 1530-1533 y 1535-1539. En Flandes estableció un estrecho contacto, entre otros intelectuales, con Luis Vives, a quien contrató como profesor, y con quien estudió Latín y Cultura clásica. Fue allí donde inició una importante labor de mecenazgo que se prolongaría toda su vida. También destacó como coleccionista de obras de arte y joyas y como apasionada bibliófila, dueña de una nutrida biblioteca. Después de la muerte de Enrique de Nassau (1538), regresó a España. Tras una temporada en el castillo de Ayora, se trasladó a Valencia, al casarse, el 13 de enero de 1541, con Fernando de Aragón, duque de Calabria y virrey de Valencia. Mencía de Mendoza sólo sobrevivió cuatro años a su segundo marido, período de tiempo en el que permaneció en Valencia, donde desarrolló una intensa actividad como mecenas y estableció estrechos contactos con varios humanistas.